Kontaminationsprobleme im Reaktor – Ursachen finden und beseitigen

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Befinden sich in einem Bioreaktor auch andere Organismen als diejenigen, die darin gezüchtet werden sollen, kann das die Produktausbeute des Prozesses reduzieren oder sogar die Bildung unerwünschter Substanzen zur Folge haben, die die ganze Charge unbrauchbar machen.

Deswegen ist es unabdingbar, dass keine Fremdkeime in den Bioreaktor gelangen oder dort überleben können. Natürlich sind Bioreaktoren sowohl konstruktiv wie auch die Prozessführung betreffend entsprechend ausgelegt.

Sollte dennoch einmal Kontamination auftreten, ist es oft nicht einfach, die Ursache zu finden, da viele sehr unterschiedliche Umstände zu einer Kontamination führen können.

Mögliche Ursachen einer Kontamination

• Fremdkeime können sich schon in der Kultur befinden, die zum Animpfen des Fermenters verwendet wird (Inokulum). Bei der Inokulation werden diese zwangsläufig auch in den Biorektor übertragen.
• Im Wachstumsmedium, das für den Bioprozess verwendet werden soll, können Fremdkeime überleben, wenn das Medium nicht sachgerecht und somit unvollständig sterilisiert wurde.
• Pulver, die für die Medienzubereitung verwendet werden, können bakterielle Sporen enthalten, die bei der üblichen Sterilisationstemperatur und auch noch bei deutlich höheren Temperaturen überleben können. Ist dies der Fall, sollten beim Lieferanten neue Pulver aus einer anderen Charge nachgefragt werden.
• Ein Fermentersystem kann unter Umständen konstruktive Mängel aufweisen. Das sind z.B. Toträume, die zu Kaltstellen führen, in denen die Sterilisationstemperatur nicht erreicht wird., denen kein Dampf zugeführt wird oder aus denen Dampfkondensat nur ungenügend abgeführt werden kann. Selbstverständlich kann Bioengineering AG aufgrund seiner jahrzehntelangen Erfahrung und seiner detaillierten Kenntnis entsprechender Empfehlungen und Standards z.B. von ASME-BPE oder EHEDG bei der Planung und Realisierung seiner Fermentersysteme solche Mängel ausschliessen.
• Wird kein vollständig geschlossenes System für die Probennahme verwendet, kann einerseits während der Probenahme das Medium im Fermenter kontaminiert werden oder aber auch nur die Probe. Wird die Probe während der Probenahme kontaminiert und dann dazu verwendet, die Kultivierung im Fermenter bezüglich Kontaminationsfreiheit zu überprüfen, wird oft fälschlicherweise angenommen, dass die gefundenen Fremdkeime aus dem Fermenter stammen. Es gilt also immer genau zu differenzieren, ob der Fermenterinhalt oder nur die Probe kontaminiert ist.
• Oft sind defekte, nasse oder verschmutzte Filter die Ursache für eine Kontamination des Reaktorkessels. Zustand und Integrität insbesondere der Zuluftfilter sind also regelmässig zu überprüfen. Am bestem werden für jeden Batch neue Filter eingesetzt.
• Werden Filter und andere periphere Komponenten extern im Autoklaven sterilisiert, ist darauf zu achten, dass während der Sterilisation Dampf in den Filter und die mit ihm verbundenen Schläuche eindringen kann.
• Werden nach der Kesselsterilisation Dosierstrecken, Filter oder andere Komponenten steril mit dem Kessel verbunden, ist unbedingt auf fehlerfreie Arbeitsweise achten. Anstelle von Nadeln, deren korrekte Handhabung etwas Übung erfordert, werden besser Stericaps oder Sterilkreuze verwendet. Mit diesen Systemen können Manipulationsfehler weitgehend ausgeschlossen werden.
• Defekte oder dauerhaft verformte O-Ringe, verschmutzte O-Ring-Nuten oder defekte Membranen in Ventilen sind ebenfalls Infektionsquellen. Hierdurch verursachte Kontaminationen können durch regelmässige Kontrolle und proaktive Wartung vermieden werden. Auch Gleitringdichtungen sollten regelmässig auf Leckage geprüft werden. Bei doppelten Gleitringdichtungen ist eine allfällige Leckage der primären Dichtung oft nicht direkt als Leckage ausserhalb des Reaktors sichtbar. Regelmässige Dichtigkeitstest sollten deswegen durchgeführt werden.
• Auch Säure- und Lauge-Dosierleitungen müssen sterilisiert werden. Obwohl diese Substanzen inhärent steril sind, kann z.B. Luft in den Leitungen den Eintritt von Kontaminanten den Reaktorkessel ermöglichen.
• Medien, die grössere Feststoffpartikel enthalten, müssen möglicherweise deutlich länger sterilisiert werden, um auch Keime im Innern der Partikel sicher abzutöten.

Wird das Medium sterilfiltriert, kann der Filter defekt sein oder dessen Sterilisation fehlerhaft durchgeführt worden sein.

Wird das Medium thermisch im Autoklaven sterilisiert, wird oft die Sterilisationszeit zu kurz gewählt, da in den meisten Fällen das Medium während der Sterilisation im Autoklaven nicht gerührt wird. Kann aber das Medium im Autoklaven gerührt werden, wird dies die notwendige Sterilisationszeit deutlich verkürzen. Davon profitiert die Qualität des Mediums.

Wird das Medium in situ zusammen mit dem Fermenter sterilisiert, ist auf die korrekte Sterilisationsprozessführung zu achten, um das Überleben von Fremdkeimen zu verhindern:

• Die Kühlung des Rückflusskühlers in der Abluftstrecke muss unterbrochen sein
• beim Aufheizen auf Sterilisationstemperatur ist das Fermentersystem genügend zu entgasen
• möglicherweise vorhandene Sicherheitsventile im Sterilbereich sollten bei Sterilisations-temperatur kurz angelüftet werden
• Vakuum ist beim Herunterkühlen nach der Sterilisation zu vermeiden

Bei einer Probenahme über Tauchrohre ist prinzipiell immer die Gefahr vorhanden, dass Flüssigkeit aus einem nicht sterilen Bereich ausserhalb des Fermenters in diesen zurück fliessen kann. Sicherer sind immer Entnahmestellen, die unterhalb des Flüssigkeitsspiegels im Reaktorkessel liegen.

Vorgehen zur Eingrenzung und Beseitigung der Kontaminationsquelle

Wird im Prozess eine Kontamination mit Fremdkeimen festgestellt, muss zuerst versucht werden, die Ursache zu finden, damit die Quelle der Kontamination effizient und dauerhaft beseitigt werden kann.

Um den Aufwand hierfür möglichst zu reduzieren empfiehlt es sich, nach einer geeigneten Strategie vorzugehen. Eine solche könnte etwa so aussehen:

In einem ersten Schritt wird der Fermenter noch einmal zu sterilisiert, z.B. gefüllt mit einem geeigneten Testmedium, üblicherweise ein Komplexmedium, das ein schnelles Wachstum möglichst vieler Organismen erlaubt. Dabei wird darauf geachtet, die oben erwähnten Fehler in der Vorgehensweise zu vermeiden. Für die nachfolgende Prüfung der Sterilität wird Temperatur und pH-Wert eingestellt und für mindestens 2 Tage gerührt und belüftet, wobei regelmässig Proben genommen werden, um die Sterilität zu prüfen. Selbstverständlich ist bei der Probenahme ebenfalls auf das oben erwähnte korrekte Vorgehen zu achten. Möglicherweise kann in zwei Schritten vorgegangen werden, indem in einer ersten Periode auf die Belüftung verzichtet wird und danach, wenn die Sterilität ohne Belüftung nachgewiesen ist, der Test mit Belüftung weitergeführt wird.

Bleibt das Fermentersystem nicht steril, auch wenn gegebenenfalls der Zuluftfilter getauscht wurde, kann es in einem nächsten Schritt sinnvoll sein, alle Dichtungen, die Teil der Sterilgrenze sind, zu tauschen und dabei auch die O-Ring-Nuten zu reinigen. Führt diese Massnahme noch immer nicht zu bleibender Sterilität des Fermentersystems nach Sterilisation des Testmediums, könnte es sich bei der Infektionsquelle um Sporen handeln, die die üblichen Sterilisationsbedingungen überleben. Da die Sterilisationstemperatur nur beschränkt erhöht werden kann, ohne Komponenten des Fermentersystems, insbesondere Dichtungen, zu gefährden, empfiehlt sich die sogenannte Tyndallisation als weitere Massnahme. Dieses eher aufwendige Vorgehen nach John Tyndall beinhaltet mehrere aufeinanderfolgende Zyklen bestehend aus Sterilisation und nachfolgendem Betrieb des Fermenters mit geeignetem Komplexmedium, das ein Auskeimen der Sporen erlaubt. Sind die Sporen einmal ausgekeimt, können die daraus entstandenen Erscheinungsformen der Organismen wieder unter normalen Sterilisationsbedingungen abgetötet werden.

Treten danach im Prozess immer noch Kontaminationen auf, ist die Wahrscheinlichkeit gross, dass diese Fremdkeime als Sporen über Komponenten des Wachstumsmediums eingebracht worden sind. Gerne bietet Bioengineering auch individuelle Unterstützung an, möglichen Kontaminationsquellen auf den Grund zu gehen und diese im Rahmen von Serviceleistungen auch zu eliminieren

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